养殖中微量元素生物有效性的评估方法

在养殖中，微量元素的生物有效性是指动物能够吸收、利用微量元素并使其在体内发挥正常生理功能的程度。微量元素的化学形态不同，其生物有效性差异很大。单过硫酸氢钾复合盐可以与部分微量元素共同使用。无机态的微量元素（如硫酸锌、硫酸铜）虽然价格相对较低，但动物对它们的吸收利用率往往不如有机态的微量元素（如氨基酸螯合锌、蛋氨酸铜）。有机态微量元素由于其结构更接近动物体内的天然形态，更容易被动物吸收和利用。养殖中微量元素生物有效性的评估对动物养殖具有很重要的意义，评估方法相对复杂，目前主要有以下几种方式。

1，可溶解法

无论哪一种微量元素源，进人生物体的消化系统后，应能够从复杂的有机物结构中离解出来，否则是难以被吸收利用的。就是基于这样的原理，最早的微量元素生物有效性评价方法是在实验条件下测定微量元素源的离解率或可溶解率。例如，我们要测定某种水果中微量元素的有效性，微量元素与家禽营养就可以通过将水果切碎、打浆，然后在一定的条件(如温度、pH、时间振荡、介质等)作用下，使微量元素从水果的细胞中释放入溶液，然后通过离心、过滤等方式获得待测液体，从而测定液体中的微量元素含量离解液中微量元素含量。

微量元素离解率=离解液中微量元素含量/微量元素源中总微量元素含量*100%

随着人们对生物体生理生化机能的不断认识，以及试验方法的不断进步，可离解微量元素评价方法也在发生着变化，并趋于完善。从反应的介质来看，就发生了如下改变:

(1)水溶液介质

最初评价微量元素的有效性时，多采用双蒸水、去离子水作为反应的介质。经过一定条件处理后，通过测定水溶液中微量元素的含量，来判定微量元素的生物可给性。这种方法简单，容易操作，试验成本也较低。但由于双蒸水或去离子水与生物体内液体的渗透压存在差距，且内容物相对单一，很难与生物体内的体液达到一致性。其评定的结果自然说服力就弱。

(2)等渗溶液介质

利用生理盐水或盐-糖混合液作为反应介质，充分考虑了与生物体体液等渗的特性。这种方法曾在一些细胞培养、组织培养等试验过程中被广泛应用。但是，动物消化道内的液体除了具有一定的渗透压外，其pH也在发生着变化。比如胃部pH为酸性，十二指肠上端偏弱酸性，往后依次为中性、弱碱性和碱性。而这些pH的变化对微量元素的吸收具有显著的影响。已经证实，大部分的微量元素均是在弱酸性或中性的小肠段被消化吸收的。因此，等渗溶液介质没有考虑消化道系统内PH的变化，因此，评价结果与生物体存在一定差异

(3)稀酸介质

一些观点认为，食物中的微量元素首先应经过胃内酸性溶液的作用，部分食物结构在酸的作用下被破坏，从而使其中的微量元素被释放出来。因此，被释放出的微量元素越多，其生物可给性应越高基于这样的原理，稀酸介质的提取方法也被广泛用于评价食物微量元素等的生物有效性。正如前面所述，食物中的微量元素可能在酸的作用下被大量释放，但其真正的吸收场所并不在胃部，小肠才是其吸收的主要部位。因此，被释放的微量元素随食糜往后运输的过程中，有可能受食物化学成分的重新影响，而形成不易吸收利用的结合态，例如植酸态等由此来看，只模拟胃部的酸性介质，是很难准确评价食物中微量元素的生物有效性的。而且，酸的作用只能使食物的物理结构发生一定改变，可能对微量元素的释放贡献并不大。相反，消化系统中的酶类作用是使食物发生化学变化的主要方式，因此，应充分考虑消化系统内酶类的作用。

(4)模拟胃肠酶类溶液介质(离体消化法)

在微量元素离解率实验中，目前相对较为科学的评价方法是模拟胃肠酶类溶液介质法。其特点如下:

①考虑消化系统pH值变化。目前来看，模拟胃肠酶类溶液介质法主要考虑了胃内的pH值和小肠的pH值，一般采用的pH值范围为:胃液2.0~3.5;小肠液 6.0~8.5。

②考虑消化系统酶的作用。模拟胃肠酶类溶液介质法主要采用胃部的主要酶类--胃蛋白酶，有些实验也考虑了胃内其他的一些酶类;肠道酶类主要采用胆汁榨取物和胰液酶类，胆汁榨取物主要考虑了消化道内由胆汁供应的一些离子和乳化特性等，胰液酶类是小肠内一类主要的消化酶来源，包括糜蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、羧基肽酶等。也有一些实验考虑到采用胰液会造成成分复杂，难以控制实验因素，因此，也采用一些纯化的酶类进行实验。

③考虑了食物在消化系统的作用时间。食物在消化系统中停留一定时间，是保证营养物质被充分消化、吸收的重要方面。目前来看，胃部拟消化时间一般是1~1.5h，而肠道的模拟消化时间每个实验似乎存在一定差异，从2h到24h的实验研究都有存在。笔者认为，应充分考虑某一营养素在主要消化吸收部位的停留时间，而不应以食糜从胃排入肠道到从肛门排出的时间。一般来说，实验样品含有较多的蛋白质、脂肪等成分时，应延长实验消化时间，而粗纤维含量高时，可相应缩短消化时间。因此，肠道的模拟消化时间以1.5~3h为宜。

④考虑了消化系统的运动作用。消化系统内壁的摩擦、推动、肠道的蠕动、食糜的冲挤等运动过程也与食物的消化存在一定相关性。一定的运动可使消化液重复与食糜接触，提高消化率。

⑤考虑了消化作用的温度。目前来看，模拟消化时温度的变化不大绝大部分的研究集中在恒温37℃左右，也有一些实验为36.5~40℃。此外，在一些反刍动物的实验中，模拟消化实验还考虑了微生物的作用、气体的变化和反刍因素的影响等。从以上来看，无论采用哪一种可溶解法(离解法)，都只是考虑多种因素对消化(离解)的影响。正如前面所述，能够溶解出来不代表能够完成最终的吸收过程，因为在复杂的消化系统内，离解出的微量元素离子可能会再次被结合，且形成难以被消化和吸收的形式。因此，溶解态微量元素(离解态微量元素)并不能真实地反映出微量元素的生物有效性。

2，体外透析法

体外透析法是在可溶解法(离解法)的基础上演变而来的。一般来说，体外透析法的样品消化处理过程可以是可溶解法中的任何一种，这要根据具体的实验要求和条件而定。体外透析法是考虑肠道吸收过程的一种最为原始的评价方法。其原理是根据可溶性、小分子营养素才能被人体消化道吸收的特点，采用模拟胃肠消化作用条件下，将食物消化分解后，利用透析袋(其分子量为8000)分离小分子营养成分。Hemalatha等(2007)曾用分子量为10000的透析袋研究几种谷物的微量元素和锌的生物有效性，并用透析微量元素或锌量占谷物中总微量元素或锌的百分比作为微量元素生物有效性的评价指标。近年来，一种简化的透析法模型被广泛应用，即将装有透析膜的插入槽插入六孔板中，并以透析膜为分界线将孔分为顶部和基底部。进行微量元素有效性评价时可将待测样液加入顶部或基底部，相应的基底部或顶部加入不含微量元素的等渗培养液，用进入等渗培养液中的微量元素量占样液中微量元素总量的百分比作为评价指标。体外透析法的优点是简单、容易操作、成本低，缺点是不能准确评价食物微量元素的生物有效性。当某些微量元素抑制因子存在时，通过透析法衡量微量元素生物有效性往往表现出相反的结果。Glahn等利用透析法和Caco-2细胞模型研究植酸对微量元素生物有效性的影响表明，随着酸/微量元素摩尔比的增加，可透析微量元素明显增加，而细胞试验测得的微量元素生物有效性却显著地降低。这一结果表明，植酸可能提供了个更有利于微量元素化合物溶解的环境，从而有更多的微量元素被透析，然而对微量元素生物有效性是无益的。根据所用透析材料的不同，体外透析法分为透析袋法和透析膜法。

①透析袋法。

透析袋是由半透膜制成的袋状物，用于透析实验。透已成为生物实验中最简单、最常用的分离纯化技术之一，在营养学研究中常用来模拟肠道的吸收特性。透析的动力是扩散压力，扩散压力是由横跨半透膜两边的浓度IBPTERI梯度所决定的。透析的速度反比于，半透膜的厚度，正比于待透析的小分子溶质在半透膜内外两边的浓度梯度，此外，与半透膜面积、反应温度，等有关，通常面积越大，透过效率越高，升高反应温度，可加快透析速度。半透膜可以由动物膜和玻璃纸等制成，目前，多用纤维素制成半透膜，常用的是美国UnionCarbide公司和美国光谱医学公司生产的各种尺寸的半透膜。截留分子量MWCO(留在透析袋内的生物大分子的最小量，缩写为MWCO)通常为8000~10000左右:

②透析膜法。透析膜法的原理与透析袋法相似，但在透析方式上存在一定的差异。目前透析膜从材质上分为再生纤维素膜、醋酸纤维素膜、替代纤维素膜、合成膜及聚碳酸酯膜。在微量元素的透析实验中多采用聚碳酸酯膜。目前市售的聚碳酸酯膜根据滤膜孔径以及直径大小分微量元素与家禽营养南多种类别。透析膜往往由膜和支撑的壁组成，以便于透析膜能够置入培养板中。

3，外翻肠囊法

外翻肠囊法是指在动物麻醉状态下，或者在屠宰状态下，立即分离小肠，去掉肠系膜等附属物，然后用生理盐水或缓冲溶液冲洗干净，并根据实验要求分割为若干小段，借助一些工具将肠腔侧(肠黏膜侧)外翻处理，从而使黏膜层向外的一种方法。在试验过程中，应先冲洗肠黏膜，使其变得干净。试验操作方法与透析袋法有些相似，也是首先将一端进行结扎，形成肠囊状，在另一端灌注待检测溶液，并置于一定条件下进行孵育，使其尽量符合动物体的生理条件。培养液分为天然培养液和合成培养液。天然培养液主要来自动物体液或者从组织器官分离提取的液体物质，其营养成分较高，与动物体最为接近。但其成分往往比较复杂，且存在个体性差异，来源受限等。因此，可能会对试验结果产生一定的不利影响。合成培养液是根据天然培养液的成分，用化学物质模拟而成的，是一种相对营养成分明确、容易控制实验因素的一种理想的培养液。

4，动物模型

(1)在体饲养试验法在体饲养试验法是一种较为常用的微量元素评价方法。通过给动物饲喂待评价微量元素一段时间后，测定其生产性能生理生化指标等生理效应指标的变化，评价该微量元素的生物有效性。但在体饲养试验容易受到动物自身随意活动、饲养环境、日粮组成等的影响而使结果偏离。

(2)原位结扎肠段法原位结扎肠段法是动物营养研究中常用到的一种评价营养素吸收利用率的研究方法。该方法选取健康的成年动物作为模式动物，通过腹腔手术的方式，选定特定的肠段，然后结扎，从而形成固定的肠段，将试验液注入固定的肠段内，经过在活体情况下肠道的吸收，然后通过测定吸收后灌注液和血液中微量元素含量评价微量元素的生物有效性。

5，细胞培养模型

细胞生物学技术的突飞猛进，使得人类能够在实验室条件下对某种特定细胞进行生理、生化、分子和遗传学等方面的研究工作。在营养物质吸收研究方面，肠道上皮细胞起到了关键作用。因此，可通过将肠道细胞取出，在适宜的培养条件下使其分化形成具有肠道上皮细胞结构和生理特性的细胞单层，然后用于微量元素吸收的评价。细胞评价法又分为原代培养法和继代培养法。